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Reactivos de Derivatización PIERCE

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DERIVATIZACIÓN EN GC

La literatura química contiene muchos datos sobre derivatización, muchos de los cuales se refieren a compuestos particulares, a clases de compuestos ya reactivos químicos. Se reconocen como estándares en el campo de la derivatización analítica a dos libros:
  • "Handbook of Analytical Derivatization Reactions", por Daniel R. Knapp(1), que ofrece una colección general de métodos de Derivatización Analítica para Cromatografía y Espectrometría de Masas (GCMS), que producen la formación de derivados covalentes antes del análisis.
  • "Silylation of Organic Compounds", por Alan F. Pierce(2), que representó un factor significativo en la transferencia de las reacciones de sililación del campo relativamente esotérico de la química orgánica del silicio al estado de ser probablemente el método de derivatización más aplicado(3).

Se derivatizan compuestos o mezclas de compuestos antes del análisis por los siguientes motivos:

  1. Para que un compuesto que no se puede analizar mediante un método particular resulte idóneo para el análisis(4).
  2. Para mejorar la eficacia analítica del compuesto(5,6).
  3. Para mejorar la detectabilidad del compuesto(7).
1. Idoneidad
A menudo los compuestos no pueden analizar porque no están en una forma adecuada para una técnica analítica particular. Los ejemplos incluyen compuestos no volátiles para análisis por GC(8,9,10), compuestos insolubles en análisis por HPLC y materiales no estables en las condiciones analíticas(11), El procedimiento de derivatización modifica la estructura química de los compuestos permitiendo el análisis por la técnica deseada(12).
2. Eficacia
El análisis directo puede resultar difícil si los compuestos interaccionan entre sí o con la columna. Estas interacciones puede causar una resolución pobre y/o picos asimétricos que causan una integración y cuantificación difícil o poco práctica. Esta interferencia puede reducirse con la conversión a productos derivados(13,14). Los compuestos que coeluyen puede separarse muchas veces usando los métodos de derivatización adecuados.
3. Detectabilidad
Al aumentar la necesidad de detectar compuestos en cantidades cada vez más pequeñas, resulta importante ampliar el rango de detección de los productos en cuestión. Esta mayor sensibilidad puede conseguirse mediante el uso de un detector específico frente a átomos o grupos funcionales específicos.
Otra aproximación popular hacia el aumento de la detectabilidad consiste en la derivatización. Una sensibilidad mayor se puede conseguir aumentando la cantidad de compuesto a analizar o vía la introducción de átomos o grupos funcionales que interacciones fuertemente con el detector(16,17). Esta técnica se usa en aplicaciones gascromatográficas, mediante la introducción de halógenos para detectores de captura de electrones(18,19), o produciendo TMS derivados para producir fragmentaciones de iones fácilmente identificables en MS(20).
Tipos de Derivados
Los compuestos que contienen grupos funcionales con hidrógenos activos (-COOH, -OH, -NH y -SH) se suelen derivatizar antes de su análisis por cromatografía de gases. Estos grupos funcionales tienden a formar enlaces de hidrógeno intermolecular que afectan a la volatilidad, pueden interactuar negativamente con la fase estacionaria de la columna y pueden ser térmicamente inestables. La sililación, acilación y la alquilación son las técnicas de derivatización usadas para alterar estos grupos funcionales mejorando sus características térmicas y cromatográficas.
El procedimiento ideal de derivatización deberá:
  1. Efectuar la modificación deseada
  2. Que sea cuantitativa, o, como mínimo, reproducible
  3. Producir productos que sean rápidamente distinguibles y separables de los materiales iniciales.
  4. Proceder rápidamente con técnicas simples de laboratorio que deberán ser selectivas y aplicables a compuestos similares.
  5. Usar reactivos y reacciones que no presenten riesgos inusuales.
Reacciones: Sililación
Los derivados con silicio son los más ampliamente usados en aplicaciones de cromatografía de gases. En general se forman por substitución de los hidrógenos activos de ácidos, alcoholes, tioles, aminas, amidas y cetonas y aldehídos enolizables con grupos TMS (TriMetilSilil). Existe una amplia gama de reactivos disponibles para la introducción de estos grupos, que difieren en su reactividad, selectividad y reacciones secundarias y en el carácter de los productos de reacción. Existe una amplia literatura disponible que permite seleccionar el reactivo de sililación más adecuado para cada problema analítico particular (1,2).
Los reactivos de sililación y los derivados TMS son inestables hidrolíticamente y deben ser protegidos frente a la humedad. Sin embargo el grado de hidrólisis de cada reactivo y derivado es diferente, y, en algunos casos, es posible preparar derivados en presencia de pequeñas cantidades de humedad(21), o aislar y purificar derivados por extracción en un solvente orgánico y lavado con soluciones acuosas(22). Los reactivos que introducen un grupo   t-Butilsililo en lugar de un grupo TMS se desarrollaron para presentar una estabilidad hidrolítica mayor(23). Estos derivados ofrecen una mayor estabilidad frente a la hidrólisis y generan perfiles de fragmentación específicos, lo que los hacen muy útiles en aplicaciones de GCMS(24).
La mayoría de los derivados TMS o TBDS tienen una excelente estabilidad térmica y resultan adecuados para una amplia gama de condiciones de inyector y columna. Sin embargo, puesto que los reactivos de sililación modificarán prácticamente todos los hidrógenos activos, es importante que no se inyecten en columnas con fases estacionarias que contengan dichos grupos funcionales. Ejemplos de fases no compatibles son los polietilénglicoles (TR-WAX o TR-WaxMS) y fases para ácidos libres (TR-FFAP).
Reacciones: Acilación
La acilación es la conversión de compuestos que contengan hidrógenos activos como -H, -SH y -NH en ésteres. tioésteres y amidas mediante la acción de una ácido carboxílico o un derivado de un ácido carboxílico(25). En aplicaciones cromatográficas, la reacción de acilación se usa principalmente para convertir las clases anteriores de compuestos en derivados que sean más adecuados para cromatografía(26) o que dan una mayor respuesta en la detección cromatográfica que el compuesto original(27).
Un ejemplo importante de esta aplicación es la inserción de grupos perfluoroacetilo en una molécula para incrementar la respuesta en detectores de Captura de Electrones (ECD).
Los acilderivados resultan también útiles en aplicaciones de Espectrometría de Masas en las que modifican los perfiles de fragmentación de los compuestos a estudiar(28).
Reacciones: Alquilación
La alquilación es la substitución de un hidrógeno activo por un grupo alifático o alifático-aromático (bencilo)(29).Esta técnica se usa para modificar los compuestos con hidrógenos activos como ácidos carboxílicos y fenoles. La aplicación principal de esta técnica es la conversión de ácidos orgánicos en ésteres, que permiten mejores cromatogramas que los ácidos libres.
Además la reacciones de alquilación pueden usarse para preparar éteres, tioéteres y tioésteres, N-alquilaminas y amidas(30). A medida que disminuye la acidez de los hidrógenos activos, ha de aumentarse la fuerza del agente alquilante. Al ser las condiciones más extremas y los reactivos más potentes, la selectividad y aplicabilidad de los métodos resulta más limitada.
DERIVATIZACIÓN EN HPLC
La falta de un detector universal en HPLC que ofrezca una alta sensibilidad (además de cierto grado de selectividad) ha obligado al desarrollo de algunos procedimientos de derivatización adecuados. La derivatización es la modificación química de un compuesto para obtener otro con propiedades más adecuadas para el procedimiento analítico utilizado. Resulta una herramienta analítica que puede usarse para ofrecer selectividad y sensibilidad.
Para desarrollar un protocolo de derivatización existen varios requerimientos:
  1. En el compuesto original ha de existir al menos un grupo polar ácido disponible para la reacción
  2. Se ha de formar un derivado único del compuesto padre.
  3. La reacción ha de ser reproducible bajo un tiempo y condiciones de reacción.
  4. La reacción debería proceder rápida y fácilmente en condicionas blandas.
  5. Los subproductos de reacción, si los hay, no deberían interferir con el análisis cromatográfico, o con la detección de la muestra.

En derivatización para HPLC pueden usarse técnicas de pre y de post derivatización, además de reacciones off y on-line. Las técnicas pre-columna ofrecen una mayor simplicidad técnica y se pueden usar para mejorar la estabilidad, la resolución, la simetría de pico y aumentar o disminuir el tiempo de retención de los solutos. FDAA (Reactivo de Marley), permite la separación y cuantificación de los isómeros ópticos de los aminoácidos (ver cromatograma). Las técnicas post-columna se utilizan principalmente para mejorar la selectividad y la sensibilidad.
Para mayor información en "Derivatización y Análisis de Aminoácidos" vea AQUÍ.

Literatura
El "Handbook of Analytical Derivatization Reactions", por Daniel R. Knapp, es una colección general de métodos de derivatización general para Cromatografía y Espectrometría de Masas, para la formación de derivados covalentes antes del análisis.
Los métodos presentados en este volumen están organizados según el tipo de muestra a derivatizar.
Los métodos incluyen fórmulas estructurales, guías experimentales y comentarios útiles.
El índice está estructurado de tal manera que se pueda encontrar rápidamente el método de interés listo para su aplicación.
Información de Producto
Código Descripción
TS-15012 Handbook of Analytical Derivatization Reactions, Knapp, D.R. Ed (1979). Published by John Wiley and Sons, Inc. Hardcover, 741 p.
Reactivos, Solventes y Accesorios Thermo Scientific Pierce
Información de Producto
Código Descripción
Catálogo Thermo Scientific Pierce de Reactivos y Accesorios para derivatización. 54 pág. 7.73 Mb.
Referencias
  1. Knapp D.R. (1979). Handbook of Analytical Derivatization Reactions, John Wiley & Sons: New York.
  2. Pierce, A.E. (1968). Silylation of Organic Compounds, Pierce Chemical: Rockford, IL.
  3. Pierce, A.E. (1968). Silylation of Organic Compounds, Pierce Chemical: Rockford, IL. p. 2.
  4. Sweeley, C.C., et al. (1963). Gas-liquid chrom. of trimethylsilyl derivatives of sugars and related substances. J. Am. Chem. Soc. 85, 2495-2507.
  5. Khalifa, S. and Mumma. R.O. (1972). J. Agric. Food Chem. 20, 632.
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