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Extracción en Fase Sólida EFS-SPE

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La Extracción en Fase Sólida sigue siendo el procedimiento de preparación de muestras de crecimiento más rápido. Es la técnica más usual en el tratamiento y concentración de muestras antes de su análisis por HPLC, HPLC/MS, GC o GCMS.

 

Procedimiento General en EFS

 
1. Etapa de Acondicionamiento La activación del adsorbente y de los grupos funcionales se consigue al pasar un volumen de solvente o mezcla de solventes apropiado a través de la columna. Los discos fritados de la columna se solvatan convenientemente. Para activar adsorbentes hidrofóbicos se usa generalmente metanol o acetonitrilo, mientras que para los hidrofílicos se usa hexano o cloruro de metileno. Se recomienda usar de 2 a 4 volúmenes de lecho.

2. Etapa de Carga de Muestra Aplicar la muestra en la parte superior del lecho de adsorbente. Los contaminantes de matriz pueden pasar por la columna sin ser retenidos, y otros componentes de la matriz pueden retenerse más o menos fuertemente en la superficie del adsorbente. Para obtener la máxima eficacia se debe controlar el caudal de la muestra. Si se desea incrementar el caudal de una muestra viscosa se pueden usar adsorbentes de 90 o 140mm. La capacidad de intercambio y la selectividad no se ven afectadas (conviene analizar la fracción no retenida para comprobar que todos los compuestos de interés han sido retenidos).

3. Etapa de Lavado El lavado permite la eliminación de cualquier resto de compuestos que puedan interferir manteniendo los analitos en el lecho de adsorbente. Se pueden usar solventes o mezcla de solventes de diferente tipo para mejorar la eficacia del lavado.

4. Etapa de Secado Las trazas de solvente se eliminan haciendo circular aire a través de la columna durante 2 a 10 minutos. Esta etapa mejora el rendimiento de extracción.

5. Etapa de Elución Se pasa un solvente adecuado por la columna para eliminar la interacción analito-solvente y eluir el 100% de los compuestos de interés. El solvente adecuado ha de tener la máxima interacción con el analito y una interacción mínima con las demás impurezas, dejándolas en el lecho de adsorbente. El volumen de elución ha de ser el menor posible para mantener alto el factor de concentración.
(Los adsorbentes con partículas pequeñas de 30 a 50mm requieren un menor volumen de elución que los adsorbentes con partículas mayores entre 90 y 140mm).

6. Etapa de Concentración Los compuestos de interés se concentran evaporando una parte del solvente. Es necesario secar el eluato con sulfato de sodio para eliminar posibles trazas de agua. La muestra concentrada ya está lista para el análisis.  
Definición de Volumen de Lecho El Volumen de Lecho se define como la cantidad mínima de solvente necesaria para humedecer una cantidad definida de adsorbente en la columna. Depende de la naturaleza del adsorbente y es aproximadamente de 120 mL para 100mg o 500 mL para 500mg de SiO2 de 60 Å.
(Si la masa de adsorbente es demasiado grande frente al volumen de solvente se puede causar una elución incompleta. Se puede causar una retención incompleta de los compuestos de interés en el caso contrario).
 
 

Selección del Adsorbente

 
Adsorbentes Hidrofóbicos En fase reversa, los grupos funcionales no polares del adsorbente actúan según las fuerzas de Van der Waals. Las cadenas alquílicas y aromáticas son grupos funcionales  que muestran afinidad con compuestos de polaridad media y baja.
Los grupos silanoles libres del adsorbente favorecen las interacciones polares.
Recomendamos el uso de la selectividad fenilo (polímeros tipo poliestireno divinilbenceno) para compuestos aromáticos, como es el caso de muchos productos de uso farmacéutico.
Adsorbentes Hidrofílicos Las fases normales permiten una limpieza eficiente de moléculas con grupos polares. Los grupos funcionales ciano (CN) pueden usarse tanto en fase normal para extraer compuestos polares como en fase reversa para la extracción de compuestos de polaridad media.
Los grupos funcionales DIOL pueden mejorar la extracción de compuestos polares frente a SiO2.
Los adsorbentes amino (NH2) pueden usarse tanto como intercambiadores de aniones débiles (para ácidos fuertes), o como adsorbente polar que puede interactuar con OH, NH, SH...
Adsorbentes de Intercambio La retención de intercambio iónico se basa en la interacción iónica. Este adsorbente crea una fuerte atracción con los grupos funcionales opuestos de los compuestos de la muestra que depende esencialmente del PH del contra-ión y de la fuerza iónica.
Las fases de intercambio aniónico fuerte (SAX) contienen una fuerte amina cuaternaria. Se usan para la extracción de ácidos débiles con una o más cargas negativas.
Las fases de intercambio catiónico fuerte (SCX) contienen un grupo sulfónico y se usan para la extracción de compuestos débilmente básicos con una o más cargas positivas.
Las fase de intercambio aniónico débil (DEAE, NH2) contienen un grupo dietilamino o amino. Se usan para la extracción de ácidos fuertes con una o más cargas negativas.
Las fase de intercambio catiónico débil (WCX) contienen un grupo carboxílico y se usan para la extracción de compuestos fuertemente básicos con una o más cargas positivas.
Adsorbentes Mixtos Los adsorbentes mixtos muestran la máxima selectividad. Las cadenas de intercambio iónico e hidrofóbicas químicamente ligadas a la sílice ofrecen una selectividad única. Esta técnica se usa para la extracción de compuestos básicos, especialmente drogas y metabolitos, en fluidos biológicos. Los compuestos que tengan funcionalidad ácida o básica son retenidos por la función de intercambio. Una etapa de lavado con un pH adecuado permite eliminar las impurezas ionizables. Una etapa de lavado con solvente orgánico elimina las impurezas retenidas por interacción hidrofóbica.

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